Уважаемые форумчане, помогите разобраться! Проблема в следующем: как анализировать полученные данные реакции ОТ-ПЦР? Вопрос на который я хочу ответить с помощью анализа данных: увеличилась ли экспрессия определенного гена после проведения определенных процедур с клетками по отношению к контрольным клеткам, без тех самых процедур. cDNA полученный из клеток я исследовали с помощью реакции ОТ-ПЦР, итак я имею данные на мой проверяемый ген X и housekeeping gene, и так для двух разных процедур. С тем что бы выяснить какая прцедура была эффективней, мне необходимо сравнит эти данные, но для этого необходимо нормализовать данные X по housekeeping gene. Как это сделать вручную или в Excel, если это возможно? Заранее благодарю.
Ребята, мой вопрос настолько глуп или никто действительно не знает, может просто долго объяснять, а потому лень? тогда хоть намекните.
nansy, уверен, единственная причина, по которой народ тебе не отвечает - все рыскают по интернету и пытаются разобраться в терминологии и сути. Чтобы сходу тебе ответить - это нужно а) разбиратья в статистике , б) быть микробиологом. Я сам врач, но с ПЦР-ами сталкивался непосредственно, сам выполнял реакцию, но решал несколько другие задачи. И то, если честно, твой вопрос я не понял. А ты представляешь как себя чувствуют те, кто только приблизительно знает что такое ПЦР? :-) Они сейчас, наверное, про ПЦР во всю читают :-) . Так что ты либо перефразируй вопрос, либо жди пока народ изучит особенности ПЦР.
Итак, nansy, если я правильно понял, ты имеешь две группы. Воздействуешь разными процедурами на ген. В контрольной группе экспрессия гена была, например в 9 случаях из 15, а в экспериментальной - в 13 из 15. Ты хочешь узнать, статистически значимы эти различия или нет? Я правильно сформулировал твой вопрос?
Если это так, как сформулировано в предыдущем посте, то подойдет любой критерий для дихотомических данных: точный метод Фишера, критерий Барнарда и методы, основанные на их идеях.
Что такое "необходимо нормализовать данные X по housekeeping gene"?
Извините за неуместный юмор (если модератор удалит коммент, то я не обижусь), но это напоминает бессмертный диалог из башорга:
- Это - сообщество любителей анимэ?
- Да
- Как пропатчить KDE под Gnom`ом?
Всем спасибо за ответы, я извиняюсь за неточность формулировок. Поясню себя. На самом деле я воздействую на стволовые клетки с помощью различных вещест, с тем что бы получить экспресию определенных генов, которые не характерны для данного вида взрослых стволовых клеток. Для упрощения, скажем что есть два разных способа воздействия на клетки. После я добываю РНК и cDNA соответственно. Затем, когда я выполняю реакцию Real time PCR, я проверяю експрессию разных генов. Колво cDNA взятое для каждой реакции одинакого. То есть экспрессия housekeeping gene тоже должна быть одинакова. Для простоты скажем, что проверяю два гена после каждой процедуры: HPRT (housekeeping gene) и ген Х. Из за того что данные по HPRT не были одинаковыми, для того что бы сравнить экспресию гена Х мне необходимо сначала как бы привести их к общему знаменателю, то есть нормализовать. ВоспросЖ как это сделать?
На самом деле, боюсь, что тут ответить будет сложно. Статистическая генетика отдельная - и быстро развивающаяся - область статистики. Проблема здесь не в том, что используется ПЦР или нет, а в том, что обычно изучается экспрессия большого количества генов и поэтому мы мгновенно влетаем в проблему множественного сравнения.
В данном случае из объяснения вроде бы следует, что проверяются только два гена (или это было упрощение?). если так, то возникает вопрос в каких единицах измерялась экспрессия? Оптическая плотность (или иной показатель, отражающий концентрацию ДНК после ПЦР)? Если так, что Вы просто делите показатель для Вашего гена Х на концентрацию HPRT в пробе. затем сравниваете эти отношения в тех клетках, который подвергались воздействию и в тех, что не подвергались.
Спасибо Плав! Дело в том что результаты ПЦР, это номер цикла, начиная с которого система начинает видеть ДНК, и так тот ген, который начинает светиться на более раннем цикле, его изначальное количество было выше. Но все же то, что я имею на руках, это те самые циклы. Для примера: 1 процедура: HPRT - 22, Х-25, 2 процедура: HPRT-23, Х-26, вот как это сравнить? Ведь каждый цикл это увелечение количества копий гена в два раза, примерно, а значит что я не могу просто так поделить эти значения. У меня не очень хорошо с математикой, поэтому я не могу с этим разобраться.
Если количество копий растет в геометрической прогрессии то можно представить себе следующее концентрация HPRT=c1*2^22, X=c2*2*^25, где с1 - исходная концентрация HPRT, c2 - концентрация Х. Тогда с2/с1=2^(25-22)=2^3=8 или с1=8*с2. Аналогично во втором примере с1=8*с2, т.е. концентрация Х в обоих случаях в 8 раз меньше концентрации HPRT. Соответстенно, для оценки концентрации Вы используете 2 возведенное в степень разности количества циклов. Можно, конечно, использовать и просто разность циклов, но тогда вы будете оценивать логарифм относительной концентрации
Всем спасибо за участие, все получилось, работу закончила и уже сдала, какое облегчение!
Форум Invision Power Board (http://www.invisionboard.com)
© Invision Power Services (http://www.invisionpower.com)