Несколько биоптатов с крысы - как анализировать? Опции

[Varta]

Допустим имеем 2 группы по 6 крыс в каждой. У каждой крысы взято по 3 биоптата. Как анализировать?
Вариант 1 расчитать среднее по 3 биоптатам для каждой крысы и сравнить 6 и 6. (скажем, сделать Манна-Уитни)
Вариант 2 сравнить 18 биоптатов одной группы с 18 другой.
Правильно конечно делать первый вариант, поскольку при втором увеличивается вклад индивидуальной вариабельности и мы недооценим риск получить различия обусловленные случайной комбинацией крыс. Но чувствительность в первом варианте достаточно мала а хочется все-таки больше.
Есть какие-нибудь ещё варианты?

[плав]

Допустим имеем 2 группы по 6 крыс в каждой. У каждой крысы взято по 3 биоптата. Как анализировать?
Вариант 1 расчитать среднее по 3 биоптатам для каждой крысы и сравнить 6 и 6. (скажем, сделать Манна-Уитни)
Вариант 2 сравнить 18 биоптатов одной группы с 18 другой.
Правильно конечно делать первый вариант, поскольку при втором увеличивается вклад индивидуальной вариабельности и мы недооценим риск получить различия обусловленные случайной комбинацией крыс. Но чувствительность в первом варианте достаточно мала а хочется все-таки больше.
Есть какие-нибудь ещё варианты?

Классическая задача дисперсионного анализа с повторными измерениями. Только вот про МУ забудьте - непараметрика для более-менее сложных дизайнов не отработана.

[DrgLena]

А что и как измерили в биоптатах? Если например, измерили активность фермента, при этом три раза измерили, чтобы взять среднее, или три раза измерили в разное время и интересует динамика, то тогда методы одни, а если результат измерения выражен бинарно - есть или нет в биоптате определенные клетки, то и подход к анализу будет другим.

[Varta]

Плав, я поняла вашу точку зрения. Я неполно сформулировала вопрос. Дисперсионный повторных не подходит, поскольку меня не интересует динамика. Биоптаты взяты в одно время с целью уменьшить ошибку измерения.
DrgLena Данные количественные. Допустим, количество нейтрофилов в поле зрения на 1 сутки после нанесения раны.
Группа исследования:
Крыса 1
12
20
30

Крыса 2
15
7
10

И т.д.
Считаем содержание нейтрофилов в ране как среднее по 3 биоптатам:
1 Крыса 20,7
2 крыса 10,7
И т д
Либо анализируем, используем выборку из 6 наблюдений
20,7
10,7
...

Либо как выборку из 18 наблюдений
12
20
30
15
7
...

Сообщение отредактировал Varta - 30.10.2008 - 18:25

[DoctorStat]

Наблюдения для одной крысы зависимы, поэтому нельзя анализировать выборку из всех наблюдений для всех крыс - 18 наблюдений. Сначала нужно усреднить данные для (внутри) одной крысы и получить выборку из 6 независимых наблюдений для каждой (из двух) групп крыс. Потом проверить эти выборки на нормальность, равенство дисперсий и отсутствие выбросов. Если обе выборки нормальны и их дисперсии равны, то применить дисперсионный анализ (или критерий Стъюдента, что для 2-х выборок одно и тоже). Если нормальность вызывает сомнения, то сравнить выборки каким-нибудь непараметрическим критерием (например, Крускала-Уоллиса).

[nokh]

Дисперсионный анализ с повторными измерениями разрабатывался и традиционно используется именно для вашего случая. Во-первых он позволяет учесть зависимый характер между измерениями, а во-вторых - разделить ошибку эксперимента на 2 части: в нашем случае - на биологическую и техническую. Изменчивость крыс внутри группы - биологическая изменчивость, а изменчивость биоптатов внутри крыс -методическая (техническая). Такой анализ будет работать и при изучении динамики (если бы 2 ваши группы характеризовали 2 временные точки), но отнюдь им не ограничивается. Дисперсионный анализ это - единственное что вы можете сделать, чтобы максимально использовать имеющуюся информацию. Работа с усредненными значениями - грубый подход снижающий мощность исследования и делающий во-многом бессмысленным вашу затею с уменьшением ошибки.
В иерархическом дисперсионном комплексе будут следующие факторы.
(1) Группы. Фиксированный фактор, отражающий различия двух групп по числу нейтрофилов при усреднении данных по крысам и биоптатам внутри групп.
(2) Крыса внутри группы. Случайный фактор, отражающий изменчивость крыс по числу нейтрофилов при усреднении данных по биоптатам от одной крысы - т.е. «внутри» крысы.
Взаимодействия факторов (Группы х Крыса внутри группы) быть не может, т.к. в каждой группе крысы свои. (Если бы эксперимент был организован так, что и в первой и во второй группах были использованы одни и те же животные - мы имели бы другой экспериментальный план (experimental design) в котором бы было такое взаимодействие).
В ошибку дисперсиооного комплекса и всего эксперимента уйдет техническая изменчивость между биоптатами внутри крысы.
Таким образом, в результате единственного анализа общая изменчивость оказывается разложенной на все возможные составляющие компоненты. Это хорошо и грамотно, поскольку если бы вы использовали только один биоптат от животного, то в ошибку эксперимента ушла бы техническая изменчивость (ошибка анализа) и биологическая изменчивость между крысами. Ошибка была бы больше и обнаружить различия межу группами при фиксированном числе экспериментальных животных было бы труднее. А непараметрика здесь вообще грубо говоря все сведет на нет. Распределение сосчитанных значений близко к логарифмически нормальному, поэтому перед анализом исходные данные - количество нейтрофилов в поле зрения - можно преобразовать логарифмированием.
Напишите какие статистические программы у вас есть. Я могу подсказать как делать такой анализ в Statistica, SYSTAT и SPSS.

P.S. Думаю, что методическая изменчивость будет очень велика если смотреть только 1 поле зрения. Она может перекрыть (и скорее всего перекроет) именчивость между кусочками ткани из разных мест раны. В этом случае изменчивость между биоптатами будет почти целиком отражать неравномерность содержания нейтрофилов в поле зрения и смысл во взятии 3х биоптатов теряется. Сколько полей зрения рекомендуется просматривать по методике которой вы работаете?

Сообщение отредактировал nokh - 31.10.2008 - 06:35

[DoctorStat]

Дисперсионный анализ с повторными измерениями разрабатывался и традиционно используется именно для вашего случая.

В данной ситуации нельзя использовать 2-х факторный дисперсионный анализ, т.к. внутри группы крысы ничем не отличаются, а в разных группах сидят разные крысы. Мы могли бы использовать 2-х факторный анализ в следующих случаях:

БЕСПОВТОРНЫЙ АНАЛИЗ.
Если бы содержание или питание крыс отличалось, то мы могли бы использовать эту переменную в качестве дополнительного фактора, чтобы с помощью многофакторного дисперсионного анализа учесть его влияние.

ПОВТОРНЫЙ АНАЛИЗ.
Если бы в разных группах сидели бы одни и те же крысы, то мы могли бы учесть индивидуальность крысы в результатах.

[nokh]

В данной ситуации нельзя использовать 2-х факторный дисперсионный анализ, т.к. внутри группы крысы ничем не отличаются, а в разных группах сидят разные крысы. Мы могли бы использовать 2-х факторный анализ в следующих случаях:
БЕСПОВТОРНЫЙ АНАЛИЗ.
Если бы содержание или питание крыс отличалось, то мы могли бы использовать эту переменную в качестве дополнительного фактора, чтобы с помощью многофакторного дисперсионного анализа учесть его влияние.
ПОВТОРНЫЙ АНАЛИЗ.
Если бы в разных группах сидели бы одни и те же крысы, то мы могли бы учесть индивидуальность крысы в результатах.

Вы обозначили самые примитивные дисперсионные комплексы. Описанный мной - сложнее. Мне вообще не нравится термин анализ с повторными измерениями, т.к. организовать повторности можно по-разному, а это постоянно приводит к путанице между истинными и мнимыми повторностями. В рассматриваемой структуре можно повторять анализ полей зрения внутри биоптата, биоптатов внутри крысы и крыс внутри группы. Можно также целиком повторить эксперимент на других животных, оставив неизменным только исследуемый фактор по которому животные делятся на 2 группы (истинная повторность). Все это будут разные экспериментальные планы и для их анализа потребуются соответствующие и разные варианты дисперсионного анализа. Поскольку здесь присутствует фиксированный по плану эксперимента фактор (одна група получала что-либо, другая - нет) - есть перекрестный компонент, поскольку присутствуют влженные эффекты (что-либо внутри чего-либо) - есть иерархический или гнездовой компонент. Поэтому такой анализ можно назвать перекрестно-иерархическим (cross-nested anova). Также, поскольку есть и фиксированный эффект (группы), и случайный эффект (крыса внутри группы) такой анализ можно назвать смешанной моделью дисперсионного анализа (mixed model anova). Также, поскольку оцениваются эффекты между субъектами и внутри субъектов такой анализ можно назвать between-within anova. Названия разные, методология одна. Классический анализ с повторными измерениями наиболее простой вариант перекрестно-иерархических группировок. Посмотрите в Монтгомери главу про живые и мертвые индексы и правила нахождения математических ожиданий для средних квадратов. Этого источника достаточно чтобы навсегда разобраться со сбалансированными дисперсионными комплексами. Несбалансированные - отдельная песня.

[DoctorStat]

Посмотрите в Монтгомери главу

Я прочитал главу "гнездовые или иерархические планы" книги Монтгомери «Планирование эксперимента». Вы правы, эксперимент с крысами можно рассчитать с помощью иерархического (гнездового) дисперсионного анализа. В качестве результата он покажет, существует ли различие:
1. между группами,
2. внутри каждой группы крыс.

С другой стороны, этот сложный анализ можно заменить более простыми и интуитивно понятными статистическими методами:
1. Убедиться с помощью однофакторного дисперсионного анализа, что крысы внутри каждой группы не отличаются (однородность групп, 2 теста)
2. Найти среднее для каждой крысы и с помощью того же однофакторного дисперсионного анализа проверить отличие между группами (1 тест)
3. Рассчитать поправку уровня значимости p-value на множественные сравнения (всего 1+2=3 сравнения)

[плав]

Я прочитал главу "гнездовые или иерархические планы" книги Монтгомери «Планирование эксперимента». Вы правы, эксперимент с крысами можно рассчитать с помощью иерархического (гнездового) дисперсионного анализа. В качестве результата он покажет, существует ли различие:
1. между группами,
2. внутри каждой группы крыс.

С другой стороны, этот сложный анализ можно заменить более простыми и интуитивно понятными статистическими методами:
1. Убедиться с помощью однофакторного дисперсионного анализа, что крысы внутри каждой группы не отличаются (однородность групп, 2 теста)
2. Найти среднее для каждой крысы и с помощью того же однофакторного дисперсионного анализа проверить отличие между группами (1 тест)
3. Рассчитать поправку уровня значимости p-value на множественные сравнения (всего 1+2=3 сравнения)

Только вот одна проблема. При переходе от 1 к 2 искуственно занижается ошибка (разброс данных внутри биоптатов игнорируется). Если бы количество наблюдений было бы большим, то это влияние было бы малым. А в данном примере игнорировать его нельзя. Поэтому, повторюсь, ДА с повторными измерениями единственный возможный тут метод анализа.

[Varta]

Спасибо за ценную информацию.
При пристальном изучении смотрю вопрос анализа нескольких биоптатов с животного уже здесь затрагивался в этой теме
http://forum.disser.ru/index.php?showtopic...&#entry5687
Но до конкретных рекомендаций дело не дошло.
На самом деле никто толком пока этого не знает, и анализируют и так и сяк. Я когда в аспирантуре писала диссертацию, смело свалила все биоптаты в кучу - по сравнению с расчетом средних различий получилось процентов на 30 больше. Позже я уже стала понимать, что делать так нельзя, но как делать, никто из тех кого я спрашивала не знал. Читая зарубежные статьи, обращала внимание на дизайн и методы расчета, но там в общем-то тоже авторы частенько предпочитали просто включить в анализ биоптаты как отдельные наблюдения и расчитать критерий Манна-Уитни, а не крыс.

Nokh, вы любезно согласились дать конкретные рекомендации

Напишите какие статистические программы у вас есть. Я могу подсказать как делать такой анализ в Statistica, SYSTAT и SPSS.

можно поймать вас на слове? Есть и Statistica и SPSS, пользуюсь и тем и тем в зависимости от задач.

Можно ли там сделать там больше уровней иерархии? Поле зрения --- биоптат ---- крыса ---- изучаемый фактор
Возможно ли на каком-то уровне ввести логарифмирование?
Например предполагаем, что по биоптатам распределение сдвинуто влево (попадаются биоптаты с значительно большим количеством нейтрофилов).
минимальное количество наблюдений? Можно ли анализировать по два-три биоптата с крысы - или тут уже смысла нет, оценка дисперсии будет слишком грубой и надо брать хотя бы 5-6.
Как часто пользовались таким анализом? Насколько результаты внушают доверие не получалось ли неожиданных?

Сообщение отредактировал Varta - 3.11.2008 - 08:35

[плав]

1) Можно ли там сделать там больше уровней иерархии? Поле зрения --- биоптат ---- крыса ---- изучаемый фактор
2) Возможно ли на каком-то уровне ввести логарифмирование?
Например предполагаем, что по биоптатам распределение сдвинуто влево (попадаются биоптаты с значительно большим количеством нейтрофилов).
3) минимальное количество наблюдений? Можно ли анализировать по два-три биоптата с крысы - или тут уже смысла нет, оценка дисперсии будет слишком грубой и надо брать хотя бы 5-6.
4) Как часто пользовались таким анализом? Насколько результаты внушают доверие не получалось ли неожиданных?

1) Можно, количество вложенных факторов может быть большим
2) Да, если Вы хорошо знаете статистическую программу, с которой работаете - в этом отношении SPSS будет лучше, чем, например, Statistica. Еще лучше использовать трансформацию Бокса-Кокса, поскольку она позволяет отобрать наиболее "эффективнй" метод трансформации данных.
3) Можно и по три (обычно, все-таки принято использовать трипликат), чем больше, тем точнее оценка внутригрупповой дисперсии. Количество наблюдений зависит от величины этой самой дисперсии
4) В литературе используется очень часто, введите в Google repeated measures ANOVA rat и получите большое количество примеров статей с использованием этого метода. Соответственно, это - стандартный метод и неожиданных результатов давать не должен.

[Varta]

repeated measures ANOVA rat это все-таки анализ повторных измерений.
Погуглила и прочитала дизайн в первых 4 полнотекстовых статьях. Там говорилось именно о повторных измерениях. В данном случае измерения выполнены у одной крысы, но они не повторные.

[плав]

repeated measures ANOVA rat это все-таки анализ повторных измерений.
Погуглила и прочитала дизайн в первых 4 полнотекстовых статьях. Там говорилось именно о повторных измерениях. В данном случае измерения выполнены у одной крысы, но они не повторные.

Вам надо ехать или шашечки? Или Вы считаете, что те, кто отвечает на вопросы умственно отсталые и не могут понять вопроса?
Итак - дизайн с повтроными измерениями означает, что принимается во внимание тот факт, что часть данных измерялась у одного и того же субъекта, а часть - у разных. Правильное название подхода - смешанные модели (mixed models), в них анализируется меж- и и внутрисубъектная вариабельность (ну что, легче стало?). Соовтетственно, есть внутрисубъектные факторы (within) и межсубъектные (between). Ввиду коррелированности измерений внутрисубъектных факторов использовать допущение независимости наблюдений, на котором строится обычный дисперсионный анализ нельзя. Поэтому должна использоваться информация о принадлежности информации одному субъекту при анализе ковариационной структуры. Поскольку такие методы ЧАЩЕ всего используются для анализа повторных измерений, их называют repeated measures. Однако нигде в анализе временная зависимость измерений не включается.
Если бы Вы потрудились посмотреть ссылки, то нашли бы на первой странице того, что дает Google вот эту
http://udel.edu/~mcdonald/stattwoway.html, где есть следующая фраза " Sometimes the repeated measures are repeated at different places rather than different times, such as the hip abduction angle measured on the right and left hip of individuals."
Если очень хочется начать с азов, возьмите хороший учебник по статистике и планируемых экспериментах, например того же Монтгомери, прочитате его весь, разберитесь, а уже потом пытайтесь найти разницу между repeated measures и взятием образцов у одного животного.

[nokh]

Выше я неправильно назвал комплекс перекрестно-иерархическим. Это - чистая иерархия, т.к. нет ни одного взаимодействия. Данные преобразуются не на этапах анализа, а в самом начале. Справедливо рекомендуемое Плавом преобразование Бокса-Кокса удобно провести в программе Attestat ( http://www.attestatsoft.com ). Комплекс строим для случая анализа нескольких полей зрения с каждого биоптата.
Этап 1. Модель
Yijkl = M + Ai + Bj(i) + Ck(ij) + El(ijk), где
Yijkl - количество нейтрофилов, M (мю) - общее для всего комплекса среднее, Ai - эффект i-той группы, Bj(i) - эффект j-той крысы внутри i-той группы, Ck(ij)- эффект k-того биоптаты внутри комбинации крысы и группы, El(ijk) - эффект l-ного поля зрения внутри всего остального (ошибка). Фактор группы фиксированный, остальные - случайные.
Этап 2.
Заполнение таблицы в SPSS
Колонка 1: Data - Исходные данные, т.е. натуральный логарифм количества нейтрофилов в поле зрения или преобразованное по Боксу-Коксу значение.
Колонка 2: Group - метка принадлежности наблюдения к группе (1 или 2)
Колонка 3: Rat - метка принадлежности наблюдения к конкретной крысе внутри группы (1, 2 или 3).
Колонка 4: Bt - метка принадлежности наблюдения к конкретному биоптату от конкретной крысы (1, 2 или 3 для в случае 3-х биоптатов).
Метку принадлежности к полю зрения ставить не нужно, дисперсия для этого компонента будет ошибкой дисперсионого комплекса.
Сохраните файл, например exper.sav и скопируйте его в корневой каталог диска С: (чтобы потом длинный путь не прописывать).
Этап 3. Анализ.
В SPSS действительно удобнее делать любые модели. Будем делать через синтаксис, т.к. это быстрее + из менюшки далеко не все модели можно построить.
File - New - Sintax. Откроется окно. В него вставить следующий фрагмент:

GET
FILE='C:\exper.sav'.
UNIANOVA
Data BY Group Rat Bt
/RANDOM = Rat Bt
/METHOD = SSTYPE(3)
/INTERCEPT = I-N-C-L-U-D-E (!!! Напишите без черточек, на этом сайте какой-то глюк - вместо набитого слова отбражаете число 5670252)
/CRITERIA = ALPHA(.05)
/DESIGN = Group Rat(Group) Bt(Group*Rat)

Далее: Run - All, OK и ждать появления таблицы результатов.

4. В Statistica 6.0. вполне удобно делать иерархические модели, но неудобно более сложные. В вашем случае строим точно такую же таблицу с теми же переменными и обозначениями.
Statistics - Advanced Linear/Nonlinear models - General linear models - Nested design ANOVA. В открывшейся форме
Переходим на закладку Options (чтобы потом не забыть с этого лучше начинать) в кнопке Random factors выделить случайные факторы Rat и Bt.
Возвращаемся на закладку Quik и заполняем кнопочки:
Variables. Dependent - Data, Categorical - Group Rat Bt
Factor codes - Select All
Between effects.
Group оставляем Not nested,
Rat делаем Nested in Group,
Bt - Nested in Group Rat (удерживая левую кнопку мыши выделить сразу оба фактора)
OK
В форме результатов смотрим таблицу дисперсионного анализа в кнопке All Effeсts.

Вставьте полученную таблицу сюда. Я поясню как ее оформить.

Сообщение отредактировал nokh - 3.11.2008 - 19:57