Работа с клетками. Выбор статистических методов, Теоретически распределение нормальное, на практике выборки малые Опции

[Sergey.Pustylnik...]

Уважаемые участники форума, добрый день!

--
Краткая версия вопроса.

Работа in vitro на клеточной линии, результаты теста снимаются спектрофотометрически в лунках планшета,
каждое измерение тройное (3 лунки на одну концентрацию вещества). Можно ли применять параметрическую
статистику для описания результатов, и проверки гипотез? Противоречие в том, что теоретически
распределение должно быть нормальным и можно пользоваться параметрической статистикой (я склонен к ней);
но практически в каждой группе всего три измерения и мне рекомендуют использовать непараметрику.

--
Развернутая версия вопроса.

Я зарегистрировался здесь, потому что очень важные детали для себя нашел в обсуждении темы:
http://forum.disser.ru/index.php?showtopic...%EE%F7%ED%FB%E5
Несмотря на то, что я в аспирантуре по биологической тематике, моя "математическая" проблема очень близка.
В теме обсуждается то, когда стоит применять параметрическую, а когда непараметрическую статистику.
У меня с моими коллегами и руководителями нет единого мнения по данному вопросу, поэтому надеюсь на
помощь профессионалов.

Сразу предупреждаю, я создаю длинный пост не для того, чтобы всех утомить,
а так как, чтобы дать квалифицированный ответ могут понадобиться детали.
Вот их я и привожу. Если детали не интересуют, то кратко вопрос я уже изложил.

Итак, задача.
Я работаю с клеточной линией фибробластов легкого эмбриона человека, культура гомогенна,
сохраняет свойства и фенотип при пересеве порядка 40-50 пассажей.
Для экспериментов высеваю по 10 000 клеток в лунку 96-луночного планшета.
Исследуется влияние 2 веществ в разных концентрациях на жизнеспособность клеток
при помощи МТТ теста. Суть его в том, что живые клетки способны восстанавливать соединение МТТ,
что приводит к образованию в клетках окрашенных кристаллов. После растворения кристаллов
оптическая плотность раствора позволяет судить об уровне жизнеспособности клеток в культуре.
(Жизнеспособность здесь - интегральный параметр, позволяющий оценить скорость роста культуры,
гибель клеток в ней, если таковая присутствует, а также уровень метаболической активности).
Каждая концентрация тестируется в трех лунках 96-луночного планшета, и между этими лунками сходимость высокая.
В результате получаются значения ОП, к примеру 0,837 0,859 0,793 в контроле и 0,435 0,482 0,455 в опыте,
которые нужно сравнить.

Отступление по поводу статистического анализа МТТ теста в статьях.
В литературе я встречал анализ результатов этого теста как с помощью параметрической статистики, так и непараметрической.
Статистическую обработку результатов проводят как при помощи t-критерия Стьюдента,
так и с использованием U-критерия Уилкоксона-Манна-Уитни. Если необходимо сравнивать все группы между собой,
в случае методов параметрической статистики используют дисперсионный анализ или вместе с t-тестом применяют поправку Бонферрони;
в случае методов непараметрической статистики применяют критерий Краскела-Уоллиса. Расхождение в подходах, видимо, связано с тем,
что в соответствии с теоретическими предпосылками распределения значений оптического поглощения в исследуемых группах должны
быть нормальными, однако в силу малых выборок (обычно 3 лунки в одном планшете) это не доказуемо . Для получения более надежных
данных исследования повторяют, но в повторяемость результатов для МТТ теста признается низкой. Мало того, некоторые работы
указывают, что у них распределение не было нормальным, что они проверяли по критерию Колмогорова-Смирнова. Но, конечно, как
они это делали - не указано. Если они брали 3 измерения, то очевидно, никакой нормальности там быть не могло.

В экспериментах на разных планшетах повторяемость не идеальна. Внутри одного планшета - хорошая.
(как указано в литературе, различия больше всего обусловлены неравномерным посевом клеток).
Доверительные интервалы для измерений чаще всего в пределах 5% от абсолютной величины оптической плотности,
соответственно я считаю выборку репрезентативной (высокая гомогенность), и считаю, что повтора достаточно одного.
Результаты по повтору должны давать близкие значения, но их, на мой взгляд, не следует сливать в одну группу с первичными.
(у них отличаются и среднее значение, и дисперсия, что не удивительно).
В результатах собираюсь приводить только расчет статистических параметров только для одного из экспериментов.

Сейчас я рассчитываю среднее значение, стандартное отклонение и доверительный интервал в MS Excel функциями
"СРЗНАЧ", "СТАНДОТКЛОН", и "ДОВЕРИТ" для отображения на графиках.
Для проверки гипотез о достоверности различий между группами я собираюсь делать так.
Подключив пакет "статистика" в Excel воспользоваться анализом данных
"Двухвыборочный t-тест с одинаковыми дисперсиями", затем при значении t-статистики больше
t критического двустороннего, считать, что есть достоверные различия (при уровне статистической значимости 0,05).
В противном случае, так не считать; различия, если они просматриваются, считать не достоверными.
Поправку Бонферрони я применять не собираюсь, у меня всего 2 вещества в 6 концентрациях,
сравнивать буду результаты контроля и концентраций, при которых заметны различия.
По большому счету интересно лишь парное сравнение с минимальной действующей концентрацией.

Мне же говорят, что нужно пользоваться непараметрической статистикой, так как образцов меньше 30.
Плюс к этому с меня просят минимум 2 повтора (итого 9 измерений), и если я все верно понял, то слить группы
измерений в разных планшетах.
Возможно мне следует сделать 30 одинаковых контролей и проверить распределение на нормальность?
Или нужно 30 опытных образцов? Позволит ли это применять параметрическую статистику?

Главный вопрос - кто прав в этом споре? Каким критерием правильнее всего пользоваться?
Есть ли ссылки на соответствующую литературу, где содержался бы разбор такого случая?
Я разбираюсь с этим уже 3 дня и самое релевантное, что я нашел - давнее обсуждение здесь на форуме.

Очень прошу помочь! Хочется понять, как же делать правильно и почему.

С уважением,
Сергей

[DrgLena]

Поскольку есть конкретные вопросы, то и анализ может быть построен таким образом, чтобы последовательно на них ответить.
Есть одна количественная величина, и нужно узнать какие факторы на нее влияют. Но чтобы, например, ответить на вопрос а), нужно определиться с повторами (номер теста). Если данные повтора участвуют в анализе, то нужно сравнить 6 значений контроля с 6 значениями каждой конкретной концентрацией (6 различных концентраций). Но в этом вопросе ничего не сказано о наличии или отсутствии фактора. Если это не важно, данных будет 12, а не 6. Т.к. исследуемых веществ два, то можно использовать GLM с двумя факторами. Концентрации предварительно обозначить как уровни фактора ( 0 -6). После чего, поскольку сравнения интересуют только с контролем, использовать критерий Даннетта.
comp conc {1} - 1,0000
1 1 0
2 1 1 0,815248
3 1 2 0,018716
4 1 3 0,323120
5 1 4 0,018057
6 1 5 0,000286
7 1 6 0,000008
8 2 0 1,000000
9 2 1 0,933008
10 2 2 0,628357
11 2 3 0,193773
12 2 4 0,000009
13 2 5 0,000008
14 2 6 0,000008

А чтобы ответить на вопрос б) посмотрите на график или используйте другой критерий post-hoc, чтобы доказать, что вещества 1 и 2 различаются по своему воздействию в концентрациях 5 и 6 (0,04 и 0,08).
На последний вопрос можно ответить, добавив еще один фактор. На рисунке посмотрите, какие сравнения вас интересуют и найдите в таблице соответствующие значения желанного ?р?.
Из своего опыта работы со спектрофотометрическими методиками могу добавить, что повторы (номер опыта у Sergey.Pustylnikov) или параллели (3 лунки) для одного и того же объекта (ткани одного экспериментального животного) служат лишь для получения более точного значения экстинции. В этом эксперименте 6 измерений одного и того же объекта сравнивают с 6-ю измерениями другого объекта. А объектов по одному в каждой группе? В любом случае лунки, как фактор с уровнями 1, 2 и 3 статистически не значимы по данным дисперсионного анализа и можно ограничиться вышеприведенными сравнениями

Эскизы прикрепленных изображений