Работа с клетками. Выбор статистических методов, Теоретически распределение нормальное, на практике выборки малые Опции

[Sergey.Pustylnik...]

Уважаемые участники форума, добрый день!

--
Краткая версия вопроса.

Работа in vitro на клеточной линии, результаты теста снимаются спектрофотометрически в лунках планшета,
каждое измерение тройное (3 лунки на одну концентрацию вещества). Можно ли применять параметрическую
статистику для описания результатов, и проверки гипотез? Противоречие в том, что теоретически
распределение должно быть нормальным и можно пользоваться параметрической статистикой (я склонен к ней);
но практически в каждой группе всего три измерения и мне рекомендуют использовать непараметрику.

--
Развернутая версия вопроса.

Я зарегистрировался здесь, потому что очень важные детали для себя нашел в обсуждении темы:
http://forum.disser.ru/index.php?showtopic...%EE%F7%ED%FB%E5
Несмотря на то, что я в аспирантуре по биологической тематике, моя "математическая" проблема очень близка.
В теме обсуждается то, когда стоит применять параметрическую, а когда непараметрическую статистику.
У меня с моими коллегами и руководителями нет единого мнения по данному вопросу, поэтому надеюсь на
помощь профессионалов.

Сразу предупреждаю, я создаю длинный пост не для того, чтобы всех утомить,
а так как, чтобы дать квалифицированный ответ могут понадобиться детали.
Вот их я и привожу. Если детали не интересуют, то кратко вопрос я уже изложил.

Итак, задача.
Я работаю с клеточной линией фибробластов легкого эмбриона человека, культура гомогенна,
сохраняет свойства и фенотип при пересеве порядка 40-50 пассажей.
Для экспериментов высеваю по 10 000 клеток в лунку 96-луночного планшета.
Исследуется влияние 2 веществ в разных концентрациях на жизнеспособность клеток
при помощи МТТ теста. Суть его в том, что живые клетки способны восстанавливать соединение МТТ,
что приводит к образованию в клетках окрашенных кристаллов. После растворения кристаллов
оптическая плотность раствора позволяет судить об уровне жизнеспособности клеток в культуре.
(Жизнеспособность здесь - интегральный параметр, позволяющий оценить скорость роста культуры,
гибель клеток в ней, если таковая присутствует, а также уровень метаболической активности).
Каждая концентрация тестируется в трех лунках 96-луночного планшета, и между этими лунками сходимость высокая.
В результате получаются значения ОП, к примеру 0,837 0,859 0,793 в контроле и 0,435 0,482 0,455 в опыте,
которые нужно сравнить.

Отступление по поводу статистического анализа МТТ теста в статьях.
В литературе я встречал анализ результатов этого теста как с помощью параметрической статистики, так и непараметрической.
Статистическую обработку результатов проводят как при помощи t-критерия Стьюдента,
так и с использованием U-критерия Уилкоксона-Манна-Уитни. Если необходимо сравнивать все группы между собой,
в случае методов параметрической статистики используют дисперсионный анализ или вместе с t-тестом применяют поправку Бонферрони;
в случае методов непараметрической статистики применяют критерий Краскела-Уоллиса. Расхождение в подходах, видимо, связано с тем,
что в соответствии с теоретическими предпосылками распределения значений оптического поглощения в исследуемых группах должны
быть нормальными, однако в силу малых выборок (обычно 3 лунки в одном планшете) это не доказуемо . Для получения более надежных
данных исследования повторяют, но в повторяемость результатов для МТТ теста признается низкой. Мало того, некоторые работы
указывают, что у них распределение не было нормальным, что они проверяли по критерию Колмогорова-Смирнова. Но, конечно, как
они это делали - не указано. Если они брали 3 измерения, то очевидно, никакой нормальности там быть не могло.

В экспериментах на разных планшетах повторяемость не идеальна. Внутри одного планшета - хорошая.
(как указано в литературе, различия больше всего обусловлены неравномерным посевом клеток).
Доверительные интервалы для измерений чаще всего в пределах 5% от абсолютной величины оптической плотности,
соответственно я считаю выборку репрезентативной (высокая гомогенность), и считаю, что повтора достаточно одного.
Результаты по повтору должны давать близкие значения, но их, на мой взгляд, не следует сливать в одну группу с первичными.
(у них отличаются и среднее значение, и дисперсия, что не удивительно).
В результатах собираюсь приводить только расчет статистических параметров только для одного из экспериментов.

Сейчас я рассчитываю среднее значение, стандартное отклонение и доверительный интервал в MS Excel функциями
"СРЗНАЧ", "СТАНДОТКЛОН", и "ДОВЕРИТ" для отображения на графиках.
Для проверки гипотез о достоверности различий между группами я собираюсь делать так.
Подключив пакет "статистика" в Excel воспользоваться анализом данных
"Двухвыборочный t-тест с одинаковыми дисперсиями", затем при значении t-статистики больше
t критического двустороннего, считать, что есть достоверные различия (при уровне статистической значимости 0,05).
В противном случае, так не считать; различия, если они просматриваются, считать не достоверными.
Поправку Бонферрони я применять не собираюсь, у меня всего 2 вещества в 6 концентрациях,
сравнивать буду результаты контроля и концентраций, при которых заметны различия.
По большому счету интересно лишь парное сравнение с минимальной действующей концентрацией.

Мне же говорят, что нужно пользоваться непараметрической статистикой, так как образцов меньше 30.
Плюс к этому с меня просят минимум 2 повтора (итого 9 измерений), и если я все верно понял, то слить группы
измерений в разных планшетах.
Возможно мне следует сделать 30 одинаковых контролей и проверить распределение на нормальность?
Или нужно 30 опытных образцов? Позволит ли это применять параметрическую статистику?

Главный вопрос - кто прав в этом споре? Каким критерием правильнее всего пользоваться?
Есть ли ссылки на соответствующую литературу, где содержался бы разбор такого случая?
Я разбираюсь с этим уже 3 дня и самое релевантное, что я нашел - давнее обсуждение здесь на форуме.

Очень прошу помочь! Хочется понять, как же делать правильно и почему.

С уважением,
Сергей

[nokh]

Свой вариант анализа прилагаю. Критика приветствуется, но черновик правиться не будет.
Обнаружил ляп: рис. 4 - просто копия рис. 3. Добавил второй вариант с правильным рис. 4.

Сообщение отредактировал nokh - 10.08.2010 - 13:28

Прикрепленные файлы

 Смешанная_модель_дисперсионного_анализа_в_пакете_Statistica.pdf ( 595,35 килобайт ) Кол-во скачиваний: 1638
 Смешанная_модель_дисперсионного_анализа_в_пакете_Statistica.pdf ( 600,89 килобайт ) Кол-во скачиваний: 3475

 

[плав]

Свой вариант анализа прилагаю. Критика приветствуется, но черновик правиться не будет.

Прекрасное и очень подробное описание. Читать всем!
Меня только вот что смущает:
1) Ортогональные контрасты - они известны своей способностью увеличивать ошибку I типа (собственно это ведь не что иное, как аналог t-теста только с общемодельной оценкой дисперсии). В пособии сделано много контрастов - соответственно резко увеличена вероятность ошибки I типа в сравнении с номинальной.
2) В комментариях по поводу post-hoc тестов - их вообще нельзя использовать, если омнибусный тест показал, что средние во всех ячейках одинаковы - это относится не только к LSD, но и к остальным, включая HSD (логика понятна - если суммарный тест говорит, что все одинаково, использование дополнительных тестов похоже на выкручивание рук с целью получить ответ "да"). Поскольку HSD значительно лучше контролирует ошибку I типа (LSD ее просто не контролирует), то соответственно, использование LSD в принципе сомнительно (если только не так, как у Вас описано, для того, чтобы убедиться, что действительно различий между группами нет, но тогда я бы брал не 0,05, а хотя бы 0,2).
И еще по поводу множественности сравнений. Поскольку концентрации 1-4 вообще не сильно различаются, надо бы было объединить их в одну группу (вынеся, например, саму концентрацию в случайные факторы - ибо в реальности это - случайный фактор) и сравнивать только две концентрации 1-4 и 5-6. (либо трансформировать переменную отклика и считать концентрации количественной переменной с использованием фактически не ДА, а ANCOVA - судя по картинкам зависимость напоминает экспоненту (1-)).

[nokh]

Спасибо за комментарии! Про либеральность ортогональных контрастов не слышал, нужно будет поднимать литературу посовременнее. Несомненно представленный вариант - только вариант, возможны улучшения. С ANCOVA мы разбирались полгода назад, выкладывал подробный материал здесь: http://forum.disser.ru/index.php?showtopic=2154&st=69 . Но включить в ANCOVA случайный фактор "Повторность" не сумею.