Работа с клетками. Выбор статистических методов, Теоретически распределение нормальное, на практике выборки малые Опции

[Sergey.Pustylnik...]

Уважаемые участники форума, добрый день!

--
Краткая версия вопроса.

Работа in vitro на клеточной линии, результаты теста снимаются спектрофотометрически в лунках планшета,
каждое измерение тройное (3 лунки на одну концентрацию вещества). Можно ли применять параметрическую
статистику для описания результатов, и проверки гипотез? Противоречие в том, что теоретически
распределение должно быть нормальным и можно пользоваться параметрической статистикой (я склонен к ней);
но практически в каждой группе всего три измерения и мне рекомендуют использовать непараметрику.

--
Развернутая версия вопроса.

Я зарегистрировался здесь, потому что очень важные детали для себя нашел в обсуждении темы:
http://forum.disser.ru/index.php?showtopic...%EE%F7%ED%FB%E5
Несмотря на то, что я в аспирантуре по биологической тематике, моя "математическая" проблема очень близка.
В теме обсуждается то, когда стоит применять параметрическую, а когда непараметрическую статистику.
У меня с моими коллегами и руководителями нет единого мнения по данному вопросу, поэтому надеюсь на
помощь профессионалов.

Сразу предупреждаю, я создаю длинный пост не для того, чтобы всех утомить,
а так как, чтобы дать квалифицированный ответ могут понадобиться детали.
Вот их я и привожу. Если детали не интересуют, то кратко вопрос я уже изложил.

Итак, задача.
Я работаю с клеточной линией фибробластов легкого эмбриона человека, культура гомогенна,
сохраняет свойства и фенотип при пересеве порядка 40-50 пассажей.
Для экспериментов высеваю по 10 000 клеток в лунку 96-луночного планшета.
Исследуется влияние 2 веществ в разных концентрациях на жизнеспособность клеток
при помощи МТТ теста. Суть его в том, что живые клетки способны восстанавливать соединение МТТ,
что приводит к образованию в клетках окрашенных кристаллов. После растворения кристаллов
оптическая плотность раствора позволяет судить об уровне жизнеспособности клеток в культуре.
(Жизнеспособность здесь - интегральный параметр, позволяющий оценить скорость роста культуры,
гибель клеток в ней, если таковая присутствует, а также уровень метаболической активности).
Каждая концентрация тестируется в трех лунках 96-луночного планшета, и между этими лунками сходимость высокая.
В результате получаются значения ОП, к примеру 0,837 0,859 0,793 в контроле и 0,435 0,482 0,455 в опыте,
которые нужно сравнить.

Отступление по поводу статистического анализа МТТ теста в статьях.
В литературе я встречал анализ результатов этого теста как с помощью параметрической статистики, так и непараметрической.
Статистическую обработку результатов проводят как при помощи t-критерия Стьюдента,
так и с использованием U-критерия Уилкоксона-Манна-Уитни. Если необходимо сравнивать все группы между собой,
в случае методов параметрической статистики используют дисперсионный анализ или вместе с t-тестом применяют поправку Бонферрони;
в случае методов непараметрической статистики применяют критерий Краскела-Уоллиса. Расхождение в подходах, видимо, связано с тем,
что в соответствии с теоретическими предпосылками распределения значений оптического поглощения в исследуемых группах должны
быть нормальными, однако в силу малых выборок (обычно 3 лунки в одном планшете) это не доказуемо . Для получения более надежных
данных исследования повторяют, но в повторяемость результатов для МТТ теста признается низкой. Мало того, некоторые работы
указывают, что у них распределение не было нормальным, что они проверяли по критерию Колмогорова-Смирнова. Но, конечно, как
они это делали - не указано. Если они брали 3 измерения, то очевидно, никакой нормальности там быть не могло.

В экспериментах на разных планшетах повторяемость не идеальна. Внутри одного планшета - хорошая.
(как указано в литературе, различия больше всего обусловлены неравномерным посевом клеток).
Доверительные интервалы для измерений чаще всего в пределах 5% от абсолютной величины оптической плотности,
соответственно я считаю выборку репрезентативной (высокая гомогенность), и считаю, что повтора достаточно одного.
Результаты по повтору должны давать близкие значения, но их, на мой взгляд, не следует сливать в одну группу с первичными.
(у них отличаются и среднее значение, и дисперсия, что не удивительно).
В результатах собираюсь приводить только расчет статистических параметров только для одного из экспериментов.

Сейчас я рассчитываю среднее значение, стандартное отклонение и доверительный интервал в MS Excel функциями
"СРЗНАЧ", "СТАНДОТКЛОН", и "ДОВЕРИТ" для отображения на графиках.
Для проверки гипотез о достоверности различий между группами я собираюсь делать так.
Подключив пакет "статистика" в Excel воспользоваться анализом данных
"Двухвыборочный t-тест с одинаковыми дисперсиями", затем при значении t-статистики больше
t критического двустороннего, считать, что есть достоверные различия (при уровне статистической значимости 0,05).
В противном случае, так не считать; различия, если они просматриваются, считать не достоверными.
Поправку Бонферрони я применять не собираюсь, у меня всего 2 вещества в 6 концентрациях,
сравнивать буду результаты контроля и концентраций, при которых заметны различия.
По большому счету интересно лишь парное сравнение с минимальной действующей концентрацией.

Мне же говорят, что нужно пользоваться непараметрической статистикой, так как образцов меньше 30.
Плюс к этому с меня просят минимум 2 повтора (итого 9 измерений), и если я все верно понял, то слить группы
измерений в разных планшетах.
Возможно мне следует сделать 30 одинаковых контролей и проверить распределение на нормальность?
Или нужно 30 опытных образцов? Позволит ли это применять параметрическую статистику?

Главный вопрос - кто прав в этом споре? Каким критерием правильнее всего пользоваться?
Есть ли ссылки на соответствующую литературу, где содержался бы разбор такого случая?
Я разбираюсь с этим уже 3 дня и самое релевантное, что я нашел - давнее обсуждение здесь на форуме.

Очень прошу помочь! Хочется понять, как же делать правильно и почему.

С уважением,
Сергей

[Sergey.Pustylnik...]

Спасибо за помощь!

Я как всегда пишу длинно и с подробностями. Но с другой стороны, мне кажется, что такая проблема не у меня одного,
и будет полезно разобрать ее на форуме.

"Про повторы недопонял: для одного повтора нельзя рассчитать ДИ, только для нескольких показателей."
Я имел ввиду то, что в одном опыте у меня три одинаковые лунки.
После чего я ставлю тот же эксперимент еще раз, это я здесь называю повтором.
Внутри одного повтора сходимость между тремя лунками намного лучше (еще бы), чем
между повторами (между первыми тремя и вторыми тремя лунками). Вот что я пытался сказать.

У меня вопрос следующий. Я создал таблицу в программе Statistica 9.1 (trial).
Обрабатываю ее при помощи Variance Components Analysis, то есть
способом Mixed-design ANOVA (сложный вариант дисперсионного анализа).
У меня есть следующие переменные:

1) номер теста (1 или 2)
2) значение дополнительного фактора (1 или 0)
3) название исследуемого соединения (comp 1 или comp2)
4) концентрация (от 0 в контроле до 0,08)
5) результат теста (число от 0 до 1,5; результаты нормировал относительно контроля = 1)

Иду во вкладку Statistics / Advanced Linear/Nonlinear Models / Variance Components;
выбираю зависимые переменные - результаты; случайные факторы - номер теста;
фиксированные факторы - дополнительный фактор, соединение, концентрация.
Затем жму окей и summary.
Получаю таблицу, где мне написаны по фактрам и их сочетаниям значения F и p
(значение критерия Фишера и уровень статистической значимости).
Строчки, выделенные красным - это факторы или их сочетания, вносящие
наибольший вклад в общую дисперсию (как я понял).
У меня это концентрация, вещество*концентрация, и перемноженные все 4 фактора.

Вопросы:
1) Верно ли я представил данные в таблице? То есть у меня все результаты в одной длинной колонке, а данные повторяются в других столбцах.
Так как есть одновременно 3 измерения с одинаковыми остальными параметрами - просто во всех колонках, кроме "результат" в строке одно и то же.
2) Все ли я верно делаю и обозначаю, проводя анализ? Верно ли я понял то, как следует "выразить на языке программы" повторы экспериментов?
3) Как сделать выводы из полученных цифр я вроде бы понимаю (может быть не на 100%, но все же). Но вот только эти выводы не совсем то, что мне нужно.
Мне нужно ответить на вопросы:
а) При каждой конкретной концентрации есть ли достоверное отличие между опытом (2 повтора по 3 лунки) и контролем (2 повтора по 3 лунки)? Каков уровень стат. значимости?
б) При каждой конкретной концентрации есть ли достоверное отличие между опытом с веществом 1 и веществом 2 (2 повтора по 3 лунки)? Каков уровень стат. значимости?
в) В каких случаях (при каких концентрациях и каких веществах) было достоверным (и было ли) влияние дополнительного фактора? Каков уровень стат. значимости?

Я практически уверен, что при помощи программы можно все это подсчитать, не перекраивая таблицу и "оставляя в анализе" все остальные данные.
(Как я понимаю, в сложном дисперсионном анализе - все данные - это одна система, которая от количества данных только "усиливается". Это так?)
Но я не знаю, как это сделать. Я пробовал разобраться с "помощью" и искать в интернете, но, к сожалению, не нашел, что нужно делать с этими вопросами.

И еще один вопрос по получению графиков. Буду очень благодарен, если кто-нибудь объяснит мне "покнопочно" что нужно сделать (у меня англ. версия).
Мне нужно, чтобы график отображал зависимость значения результата - среднее по 6 измерениям (это 2 повтора) + дов. интревал - от концентрации.
При этом на графике данные по обоим веществам, но только по одному значению дополнительного фактора.
Я уже по-разному пробовал, но программа не отделяет для построения графика только те данные, которые мне нужны; я не умею это задать.
В Excel это получается сделать очень просто (ну там-то я таблицы делаю каждый раз соответствующие), а здесь столько дополнительных кнопок, вкладок, опций - что я немного запутался.
И еще, умеет ли программа расставлять значки достоверности? Если да, то как сделать, чтобы она их расставила? (Это к вопросам а) и б))
Просто не хочется все обрабатывать одновременно в двух программах, если можно в одной.

Буду рад любым советам, помимо ответов на вопросы. Может быть, я просто поленился найти, и где-то мои вопросы подробно расписаны?

Небольшой вопрос к nokh и плав:
Если сложный вариант дисперсионного анализа - это то, что нужно (я и сам, почитав про дисперсионный анализ, пришел к этому выводу),
а остальные критерии менее мощные и теряют информацию, то для меня еще вопрос как это доказывать
и объяснять тем людям, кто рассуждает по принципу - "мало измерений - значит подойдет только непараметрика".

Подход DoctorStat "давайте для начала возьмем самую низкую концентрацию исследуемого вещества и самую высокую.
И для каждой концентрации зальем клетки не в 3 лунки, а во все 96 лунок планшета. Построим распределение (выборочную гистограмму)
оптической плотности и проверим его на нормальность. Если для крайних концентраций веществ статистический тест(ы) не даст отклонения
от гаусса, то есть надежда, что и для промежуточных концентраций веществ распределение нормально." кажется мне не совсем корректным,
я не могу строго доказать почему, может быть это всего лишь мое личное ощущение... Более того - это затратно для каждого аналогичного теста
такое проверять. C относительно недорогим МТТ тестом это еще можно проделывать, но что делать с иммуноферментным анализом,
где принципы обработки результатов будут совершенно идентичны, а вот цена вопроса значительно подрастет?
К тому же не всякое анализируемое вещество столь дешево синтезировать, чтобы заливать в максимальной концентрации в 96 лунок.

Есть ли литература, которая разбирает подобные примеры и показывает что сложный вариант дисперсионного анализа - именно оптимум, жестко?
Есть ли возможность сослаться на теоремы, статьи, разделы книг? Или то, что вы говорите основано на опыте и напрямую не описано?
Хочется иметь неопровержимую линию доказательств Мне же защищать не только результаты, но и обработку, которая вела в выводам!

nokh, скажите, пожалуйста, как проверять на нормальность распределение остатков? Как запустить критерий Шапиро-Уилка в Statistica?

[nokh]

Впервые слышу, что малые выборки нужно обсчитывать непараметрикой. Т.к. непараметрические методы менее мощные, для отклонения нулевой гипотезы с их помощью требуется больше наблюдений. Это есть во ВСЕХ учебниках. Т.е. как раз в случае малых выборок имеет смысл искать любые способы преобразования данных лишь бы потом смочь воспользоваться параметрикой.

Данные организованы верно, анализ проведён неверно. В Statistica нужно использовать модуль GLM и правильно задать расположение одних эффектов "внутри" других, но у меня есть сомнения, что данный пакет справится с этой задачей. Появился дополнительный фактор, дизайн ещё более усложнился, версии 5 и 6 пасовали перед такими сложными анализами. Я обсчитывал подобные дисперсионные комплексы в SPSS и расчёты занимали до 15-20 мин на компе с 2 ГГц процессором. Пока пошагово проинструктировать что нужно делать в Statistica не смогу, к тому же у меня нет девятой версии.

Предлагаю сделать так:
Вы скинете в личку файл с данными или их полноценной частью (т.е. чтобы были представлены все интересующие эффекты, но скажем не все концентрации или лунки - у людей бывают страхи что данные украдут:), сохранёнными в формате старых версий (5 или 6). Я покручу их - посмотрю для начала возьмёт ли их Statistica 6. Остальное будет зависеть от этого. Только впишите в описание данных дополнительный фактор - т.к. пока непонятно куда его вкладывать. Пока буду смотреть - скачайте книгу Монтгомери Д. К. Планирование эксперимента и анализ данных - пока это лучший учебник на русском языке по дисперсионному анализу, хотя и устаревший (в нём нет описания дисперсионного анализа в терминах GLM). Разберитесь с главами 6, 7, 11 и постарайтесь построить модель для своего случая.

Сообщение отредактировал nokh - 16.07.2010 - 05:56